藥物的含量是指藥物中所含主成分的量，是評價藥物質(zhì)量的重要指標(biāo)。藥物的含量通常運用化學(xué)、物理學(xué)或生物學(xué)及微生物學(xué)的方法測定，它是評價藥物質(zhì)量的主要手段，也是藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。藥物的含量測定可分為兩大類，即基于化學(xué)或物理學(xué)原理的“含量測定”和基于生物學(xué)原理的“效價測定”。其中，效價測定法（包括生物檢定法、微生物檢定法、酶法）的方法建立與驗證過程各具特殊性，本章將主要探討基于化學(xué)或物理學(xué)的“含量測定”。

 

      藥物含量測定的分析方法主要包括：容量分析法（滴定法）、光譜分析法和色譜分析法。其中，容量分析法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，方法耐用性高，當(dāng)方法缺乏專屬性，主要適用于對結(jié)果準(zhǔn)確度與精密度要求較高的藥品測定；光譜分析法簡便快速，靈敏度高，并具有一定的準(zhǔn)確度，但方法專屬性稍差，主要適用于對靈敏度要求較高、樣本量較大的分析項目；色譜分析法則具有高靈敏度與高專屬性，并具有一定的準(zhǔn)確度，但其結(jié)果計算需要對照品，本法主要使用于對方法的專屬性與靈敏度要求較高的復(fù)雜樣品的含量測定。

 

一、容量分析法

      容量分析法（也叫滴定法），是將已知濃度的滴定液（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液）由滴定管滴加到被測藥物的溶液中，直至滴定液中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（常稱為滴定劑）與被測藥物反應(yīng)完全（通過適當(dāng)方法指示），然后根據(jù)滴定液中滴定劑的濃度（一般稱為滴定液濃度）和被消耗的體積，按化學(xué)計量關(guān)系計算出被測藥物的含量。

（一）容量分析法的特點與使用范圍

1.容量分析法的特點

（1）方法簡便易行：本法所用儀器價廉易得，操作簡便、快速。

（2）方法耐用性高：影響本法測定的試驗條件與環(huán)境因素較少。

（3）測定結(jié)果準(zhǔn)確：通常情況下本法的相對誤差在0.2%以下，適用于對準(zhǔn)確度要求較高的試樣的分析。

（4）方法專屬性差：本法對結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)或其他干擾測定的雜質(zhì)缺乏選擇性，故一般適用于主成分含量較高的試樣的分析。

2.容量分析法的使用范圍

      由于容量分析法具有以上特點，被廣泛應(yīng)用于化學(xué)原料藥物的含量測定，而較少應(yīng)用于藥物制劑的含量測定。

（二）容量分析法的有關(guān)計算

1.滴定度

       指每1ml規(guī)定濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y藥物的質(zhì)量，《中國藥典》用毫克（mg）表示。例如用碘量法測定維生素C的含量時，ChP規(guī)定：每1ml碘滴定液（0.05mol/L）相當(dāng)于8.806mg的C₆H₈O₆（維生素C）。

2.滴定度的計算通式

 T（mg/ml）=m×（a/b）×M

      式中，m為滴定液的摩爾濃度（mol/L）；a、b分別為滴定反應(yīng)式中被測藥物與滴定劑的摩爾數(shù)；M為被測藥物的毫摩爾質(zhì)量（分子量，以mg表示）。

3.含量的計算

      此法測定藥物含量時候，有直接滴定和間接滴定兩種。

 

（1）直接滴定法：本法是用滴定液直接滴定被測藥物，則被測藥物的百分含量計算公式如圖所示，


 

        式中，W是稱取量，V是消耗體積，T是滴定度

（2）間接滴定法：包括生成物滴定法和剩余量滴定法。

 二、光譜分析法

       光譜分析法所用的波長范圍包括從紫外區(qū)至紅外區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見分光光度計、紅外分光光度計、熒光分光光度計、原子吸收分光光度計，以及光散射計和拉曼光譜儀。

《中國藥典》收載的常用的分光光度法有：紫外-可見分光度法、紅外分光度法和原子吸收分光光度法等。

（一）紫外-可見分光光度法

        本方法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于藥物的鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。

1.朗伯比爾定律

      在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比，如圖式子：



 

 2.方法特點與適用范圍

（1）鑒別易行：本法使用的儀器價格較低廉，操作簡單，易于普及。

（2）靈敏度高：本法靈敏度可達(dá)10^-6g/ml，適用于低濃度試樣的分析。

（3）準(zhǔn)確度較高：本法的相對誤差不大于2%，適用于對測定結(jié)果的準(zhǔn)確度有較高要求的試樣的分析。

（4）專屬性較差：本法通常不受一般雜質(zhì)的干擾，但對結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)缺乏選擇性。

3.儀器校正和檢定

（1）波長：由于環(huán)境的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動。除了應(yīng)定期對所用儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。

（2）吸光度的準(zhǔn)確度：可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。

（3）雜散光的檢查：可按照表格4-2所累的試劑和濃度，制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合規(guī)定。


 

三、色譜分析法

       色譜分析法是一種分離分析方法，是根據(jù)混合物中被分離物質(zhì)的色譜行為差異，將各組分從混合物中分離后再選擇性對被測組分進(jìn)行分析的方法。因此色譜分析法是分析混合物的最有力手段。色譜分析法分為：

1.依據(jù)分離方式分類

      可分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

2.依據(jù)分離原理分類

      可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法與分子排阻色譜法（凝膠色譜法）等。

（一）高效液相色譜法（HPLC）

1.方法的特點與適用范圍：

（1）高靈敏度：根據(jù)檢測器的不同，HPLC的最低檢出濃度可達(dá)10^-12～10^-9g/ml。

（2）高專屬性：HPLC可有效分離復(fù)雜基質(zhì)樣品中與被測組分結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)雜質(zhì)或無關(guān)干擾物，檢測信號具有較高的專屬性，可實現(xiàn)對被測組分的選擇性檢測。

（3）高效能與高速度：HPLC通�？稍�10～20分鐘內(nèi)完成藥物的定量分析，或在30分鐘內(nèi)完成藥物復(fù)方制劑中多組分同時定量測定，也可在60分鐘內(nèi)完成藥物中有關(guān)物質(zhì)的分離與同時定量。

2.測定法

      定量測定時，可根據(jù)供試品或儀器的具體情況以峰面積或峰高計算。目前大多數(shù)以峰面積計算。常用兩種方法如下：

（1）內(nèi)標(biāo)法：按各品種項下規(guī)定，精密稱定藥物對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別制成溶液，各精密量取適量，混合制成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。分別測量藥物對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰面積或峰高，按式子計算校正因子f：


 

      式中，A_S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積（或峰高）；A_R為藥物對照品的峰面積（或峰高）；C_S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；C_R為對照品的濃度。

      再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物在的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品中被測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的峰面積或峰高，按式子計算含量：


 

       式中，A_X為供試品中被測藥物的峰面積（或峰高）；c_X為供試品溶液的濃度；f為校正因子；A'_S和c'_S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積（或峰高）和濃度。

      采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對結(jié)果的影響。

（2）外標(biāo)法：按各品種項下的規(guī)定，精密稱量對照品和供試品，制成溶液，分別精密取一定量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中被測物質(zhì)的峰面積（或峰高），按式子計算含量：


 

       式中，A_X為供試品中被測藥物的峰面積（或峰高）；A_R為藥物對照品的峰面積（或峰高）； C_R為對照品的濃度。

       外標(biāo)法簡便，但要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確及操作條件穩(wěn)定。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定含量時，以手動進(jìn)樣器定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為宜。

（二）氣相色譜法（GC）

      氣相色譜法采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。

1.方法的特點與適用范圍

      本法主要應(yīng)用于具有揮發(fā)性或其衍生物具有揮發(fā)性的藥物及其相關(guān)物質(zhì)的分析，在ChP2015中被廣泛應(yīng)用于殘留溶劑測定法，也應(yīng)用于水分測定法、酒劑或酊劑中甲醇量檢查法等相關(guān)雜質(zhì)的檢查和維生素E等部分脂溶性較強的藥物及其制劑的含量測定等。

2.測定法

      分為內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法及加入法測定。內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法同高效液相色譜法，這里主要介紹加入法：

精密稱取被測組分對照品適量，制成適當(dāng)濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入至供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定被測組分含量，再扣除加入的被測組分對照品的量，即得供試品中被測組分的含量。

       由于加入對照品溶液前后校正因子應(yīng)相同，即：


 

       式中，c_X為供試品中被測組分X的濃度；A_X為供試品中被測組分X的色譜峰面積；△c_X為所加入的已知濃度的被測組分的對照品的濃度；A_is為加入對照品后被測組分X的色譜峰面積。

      由于氣相色譜法的進(jìn)樣量一般僅數(shù)微升，為減小進(jìn)樣誤差，尤其當(dāng)采用手動進(jìn)樣時，由于留針時間和室溫等對進(jìn)樣量也有影響，故以采用內(nèi)標(biāo)法定量為宜；若采用自動進(jìn)樣器進(jìn)樣時，由于進(jìn)樣重復(fù)性的提高，在保證分析誤差的前提下，也可采用外標(biāo)法定量。

       當(dāng)采用頂空進(jìn)樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法結(jié)果為準(zhǔn)。